反相高效液相色谱缓冲体系PH的选择

在反相高效液相色谱（HPLC）分析中，缓冲体系pH的选定对实验结果具有重要影响。以下是对反相高效液相色谱缓冲体系pH选择的详细讨论：

一、何时需要缓冲液

_{在反相液相色谱分析中，流动相的pH值一般在2.5到7之间。当被分析物在反相条件下可离解，或样品的pH值在此范围之外时，就需要使用缓冲液。这是因为可离解的化合物（如含有氨基和羧基的化合物）的Pka值通常在1-11之间，选择正确的缓冲液pH值可以确保这些可离解的官能团以一种形式（离子形式或中性化合物形式）存在，从而优化分离效果。}

二、如何选择缓冲液pH值

1. 了解被分析物的Pka：

• 在选择缓冲液pH值之前，首先需要了解被分析物的Pka值。Pka是化合物离解常数的负对数，它决定了化合物在不同pH值下的离解程度。

2. 选择高于或低于Pka两个单位的pH值：

• 根据HH公式（PH=Pka+log([A-]/[A])），当溶液pH值高于或低于Pka两个单位时，化合物中99%以一种形式存在。这种单一形式的化合物有助于获得尖锐、对称的色谱峰，从而提高分析的准确性和重现性。

3. 考虑缓冲液对柱子的影响：

• 如果样品的pH值可能对色谱柱造成损害，缓冲液可以使其变得温和，从而减小对柱子的伤害。

三、缓冲液的选择与应用

1. 缓冲液类型：

• 常用的缓冲液包括磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。在选择缓冲液时，需要考虑其缓冲范围、溶解度和对色谱柱的兼容性。

2. 钾盐与钠盐的选择：

• 在氨基化合物分析中，钾盐通常比钠盐更好。例如，PH=3的磷酸钾盐在含羧基和氨基化合物分析中表现出良好的性能。

3. 离子对试剂的应用：

• 当被分析物以离子形式存在时，可能需要使用离子对试剂（如四丁基铵盐、十四烷基磺酸钠等）来与其配对，从而改善分离效果。

四、实例分析

以反相高效液相色谱法分析腺苷酸为例，通过实验发现，使用HypersilBDSC18柱和20mmol/L磷酸钠缓冲液（pH为5.950）作为流动相时，可以有效地将三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）和一磷酸腺苷（AMP）分离。整个分析过程只需8.10分钟，证明了正确选择缓冲液pH值对于优化分离效果的重要性。

五、注意事项

1. 避免pH值接近Pka：

• 如果样品的Pka与流动相的pH值非常接近，那么流动相pH微小的变化都可能引起样品保留时间的较大变动。因此，在选择缓冲液pH值时，应尽量避免这种情况。

2. 试验后调整流动相：

• 在进行完液相色谱分析后，需要顺序调整流动相，从水到有机相，以确保色谱柱的清洁和稳定。

综上所述，正确选择反相高效液相色谱缓冲体系的pH值对于优化分离效果、提高分析的准确性和重现性至关重要。在选择缓冲液时，需要综合考虑被分析物的Pka值、缓冲液的缓冲范围、溶解度和对色谱柱的兼容性等因素。